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清醒大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術的建立和應用
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      網絡出版時間:2014-01-03清醒大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術的建立和應用馮悅華1羅光華陳立新2經頸靜脈給予SD大鼠輸注20%脂肪乳(脂肪乳組)和5%葡萄糖6 h(對照組),行高胰島素-正血糖鉗夾實驗測定血漿遊離脂肪酸(FFA)和GIR.結果與葡萄糖輸注的對照組比較,脂肪乳組大鼠輸注20%脂肪乳6h後,血漿FFA水平升高到對照組的17.6倍(P 27%(P<0.001),胰島素抵抗非常明顯。結論成功建立大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術,給大鼠輸注脂肪乳可導致明顯的胰島素抵抗。
  脂肪酸;胰島素抵抗是評價膜島素敏感性的金標準n-2.國內關於此技術應用於實驗動物(大鼠)的報道目前為止大多可分兩類,一類是在術後麻醉狀態下進行,或者是術後第2天清醒狀態下進行,但麻醉或術後造成的胰島素抵抗影響極大;另一類研究的比較多,是給大鼠尾動靜脈插管而行替代實驗,避免大範圍損傷但需長期維持局部麻醉,目前未被國際廣泛認可。本研究根據國外報道結合實際操作方法建立了大鼠清醒狀態下的HEC技術,並且通過給正常大鼠短期輸注脂肪乳,初步建立脂毒性胰島素抵抗模型,從而為研究脂毒性胰島國家自然科學基金資助項目(項目編號:81071414);江蘇省自然科學基金資助項目(項目編號:BK2011245);常州市應用基礎研究基金資助項目(項目編號:C20122012)素抵抗提供客觀依據。
  1材料與方法1.1實驗動物準備選用250~300 g的SPF級雄性SD大鼠10隻,購置並飼養在中國科學院上海實驗動物中心,條件:12h明暗交替,室溫22~25尤,濕度40%~70%.動物購人後適應性喂養1周,期間飼以基礎飼料,自由攝食飲水。
  在正式開始鉗夾實驗7d前,10%水合氯醛麻醉大鼠,行左頸動脈-右頸靜脈插管術。在無菌狀態下切開頸部皮膚,鈍性分離皮下組織和肌肉,暴露右側頸靜脈和左側頸動脈。
  石矽膠管2根(內徑0.5 IU/mL肝素化處理,分別植人頸動、靜脈。靜脈導管置於右心房水平,動脈導管置於主動脈弓水平,2根導管均經皮下隧道延至頸背部引出,見。導管用生理鹽水(含50IU/mL的肝素)衝洗,最後用500IU肝素和300g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管。
  術後單籠飼養。大鼠術後恢複1周,待體質量恢複、活動如初時進行清醒狀態下脂肪乳輸注和HEC實驗,見。
  1.2大鼠脂肪乳輸注合並HEC實驗大鼠隔夜禁食12對照組脂肪乳組脂肪乳輸注對大鼠血漿FFA的影響200-大鼠左頸動脈及右頸靜脈置管圖大鼠脂肪乳輸注和高胰島素-正常血糖鉗夾實驗圖以隨機數字表法分為2組,每組5隻。對照組頸內輸注5%葡萄糖加肝素鈉(葡萄糖購於華裕製藥有限公司,肝素鈉購於常州千紅生化製藥股份有限公司),脂肪乳組頸內輸注20%脂肪乳加肝素鈉(20%脂肪乳購於華瑞製藥有限公司)。
  2組大鼠分別從頸動脈抽取血液,羅氏羅康全活力血糖儀測定基礎血糖(BBG)。然後分別通過頸靜脈持續輸注20%脂肪乳加肝素和5%葡萄糖加肝素6h,20%脂肪乳或5%葡萄糖輸注率為10mL.kg-1.h-1,合並肝素(速率為0.097 5IU/min),並在最後90min引人HEC實驗。HEC實驗開始後,在輸注原液體的同時恒定輸注胰島素10每5min測定血糖1次。當血糖值低於5.0mmol/L時開始輸注20%葡萄糖(購於Amresco公司),調整葡萄糖輸注速率使血糖控製在5.06.0 mmol/L左右。取穩定狀態及以後的血糖值的均數為穩定血糖濃度(SBG)。記錄穩態下連續35次葡萄糖輸注速率,其均值即為此大鼠的葡萄糖輸注率(Glucoseinfusionrate,GIR)1.實驗結束後將大鼠處死,取肝組織凍於液中備用。
  1.3統計學方法米用GraphPad Prism5.0統計軟件對數據進行處理,實驗數據以均數±標準差G±S)表示,2組間的比較采用£檢驗,P <0.05為差異有統計學意義。2結果2.1各組穩定血糖濃度比較2組間BBG和SBG波動在6.30mmol/L和5.55mmol/L左右,差異無統計學意義(屍>0.05),見表1.表1 2組初始血糖和穩定血糖濃度比較(mmol/L±s)組別對照組脂肪乳組均2.2脂肪乳輸注對血漿FFA、GIR影響大鼠輸注20%脂肪乳6h後,血漿FFA水平升高到對照組(輸注5%葡萄糖)的17.6倍(11.20,P對照組脂肪乳組脂肪乳輸注對大鼠GIR的影響3討論自1983年Kraegen等建立大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術以來,國外已經廣泛使用,成為研究胰島素抵抗的基本技術之一。但在國內未能普遍使用,原因主要是傳統的HEC技術需要在大鼠體內留置導管1周以避免術後應激,雖然結果準確可靠,但是術後感染、大鼠咬斷導管,尤其是導管堵塞等問題常導致整個實驗失敗。也有人用麻醉狀態下頸動靜脈或者股動靜脈插管術進行鉗夾實驗,但麻醉狀態下血糖濃度顯著升高,大腦及骨骼肌糖利用減少,胰島素拈抗激素分泌增加,本身存在胰島素抵抗,不能真實反映大鼠體內實際情況,所以必須保證大鼠在清醒狀態下施行HEC技術。針對上述問題,本研究嚐試將傳統方法進行完善:一是手術操作中對組織的損傷盡可能減小,穿刺時盡量避開肉眼可見血管,以防頸部出血壓迫窒息;二是改變封管的方法,用500IU肝素和300g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管1周後再通的概率能提高70%~80%.兩方麵聯合改進,降低了實驗成本,增強了實驗數據穩定性。因此,本改進方法具有一定可行性和可靠性。
  胰島素抵抗是2型糖尿病的特征,研究表明血漿FFA濃度增加在胰島素抵抗的發病機製中起著重要的作用’國內多采用高脂喂養方式製備脂毒性大鼠胰島素抵抗模型,但長期高脂飲食可刺激大鼠代償性分泌一些胃腸激素激活脂蛋白酯酶(LPS),從而減輕胰島素抵抗。不同於此種方法,筆者采用短期6h輸注脂肪乳使FFA升高,直接觀察高FFA對大鼠胰島素敏感性的影響,同時采用經典的HEC技術評價胰島素抵抗。結果發現,大鼠輸注20%脂肪乳6h後,血漿FFA水平升高17.6倍,同時GIR下降了27%,成功複製了大鼠脂毒性胰島素抵抗模型。此實驗結果與之前通過輸注脂肪乳從而建立胰島素抵抗模型的數據基本一致。
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